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論文分享 | 耐思細胞小室助力中山大學附屬第五醫院“噴霧”抗癌，小鼠肺轉移清零


文章名稱：Lung metastasis and recurrence is mitigated by CAR macrophages, in-situ-generated from mRNA delivered by small extracellular vesicles

中文名稱：由小型細胞外囊泡遞送mRNA在體內生成的CAR巨噬細胞可顯著抑制肺癌轉移與復發

雜志名：nature communications

期刊影響因子：15.7
第一作者：Yuchen Xiao, Tianchuan Zhu
通訊作者：Xi Huang
發表日期：2025.8.4

https://doi.org/10.1038/s41467-025-62506-2



研究內容

概述：

本文設計了一種吸入式的納米遞送系統：
把編碼CAR（靶向間皮素）的 mRNA 放到小型細胞外囊泡（sEV）里，并在囊泡表面裝上能識別 M2 型巨噬細胞表面受體 CD206 的單鏈抗體片段。
這樣吸入后，這些帶有識別標記的囊泡會在肺里累積，并被M2 巨噬細胞攝取。囊泡里的mRNA 在巨噬細胞內被翻譯為 CAR 蛋白，從而把這些巨噬細胞改造為有抗腫瘤吞噬能力的 CAR-M。
與體外培養再回輸的細胞療法相比，這種原位（in-situ）生成 CAR-M 的方式，避免了復雜的細胞制造過程，并減少了全身給藥導致的肝臟富集問題。
動物實驗表明：吸入給藥能減少肺轉移腫瘤量、延長生存，并促進免疫記憶，能有效抑制腫瘤復發。


研究背景

腫瘤的轉移與復發，是導致癌癥死亡的主要原因。肺是常見的轉移位點，傳統的CAR-M（嵌合抗原受體改造的巨噬細胞）在治療實體瘤上前景不錯，但面臨制造復雜，以及靜脈注射后主要在肝臟累積以至肺可達性差等問題。本文提出：如果能在腫瘤所在器官（肺）原位把巨噬細胞改造成CAR-M，就能避開這些問題并提升治療效果。



實驗方案

1.sEV 設計與制備

構建表達mesothelin（MSLN）特異性 CAR 的 mRNA（CAR^{mRNA}）；并將其裝載進工程化的小型細胞外囊泡（sEV）。
在sEV 表面整合 anti-CD206 scFv（記作 aCD206）以靶向 M2 型巨噬細胞，并通過額外修飾（如 L7Ae/C-box 模塊、Cx43 修改等）提高 mRNA 裝載與遞送效率。對 sEV 的形貌（TEM）、蛋白標志（CD63、TSG101 等）和 mRNA 含量做了表征。
2.體外驗證（巨噬細胞培養與功能驗證）
用骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）極化成 M2 型后，檢測 sEV 的攝取（internalization）、CAR mRNA 的翻譯（用 EGFP 替換 CAR 作示蹤）、以及 CAR 蛋白的表達（流式/免疫熒光/Western blot）。
評估CAR-M 的功能性：對靶細胞（B16 小鼠黑色素瘤細胞構建的 MSLN 表達系）進行吞噬實驗、細胞毒性實驗、細胞因子釋放檢測等。
3.免疫細胞互作與轉錄/信號通路檢測
用Transwell 共培養（sEV 處理后的 BMDM 在下室，T 細胞或 DC 在上室）評估 CAR-M 對 T 細胞增殖、DC 成熟等的旁分泌/抗原呈遞影響（用 CFSE 標記 T 細胞，流式分析） 。同時用 qPCR / heatmap / western blot 檢測吞噬后上調的信號通路（如 AKT、NF-κB、ERK）。
4.體內給藥與抗腫瘤療效
在小鼠肺轉移模型中比較吸入（inhalation） 與靜脈注射兩種給藥方式的組織分布（Fluc 或 DiR 示蹤）、巨噬細胞中 CAR 表達、腫瘤生長（生物發光、病理切片）、腫瘤微環境（流式細胞譜系分析、細胞因子測定）和長期復發/生存率。


CARmRNA@aCD206 sEVs制備過程示意圖


CARmRNA@aCD206在肺轉移癌中的靶向遞送及抗腫瘤機制。

實驗結果

1.sEV 能有效加載并攜帶 CAR mRNA，工程化sEV 在形貌、表面標志與 mRNA 含量上得到良好驗證。

2.體外：aCD206-修飾的 sEV 更易被 M2 BMDM 攝取，能夠在細胞內產生 CAR（EGFP 示例證明翻譯），并使巨噬細胞表現出增強的抗原特異性吞噬、釋放更多促炎細胞因子（IFN-γ、TNF-α），在體外對 MSLN 陽性腫瘤細胞的吞噬與細胞毒性更強。

3.免疫互作：在Transwell 共培養中，CAR-M 能通過旁分泌或抗原遞呈促進 T 細胞增殖并誘導 DC 成熟（Transwell 里上室的 CFSE-標記 T 細胞與 DC 的指標顯示出明顯提升），提示 CAR-M 有助于激活適應性免疫并可能引起“表位擴展”。

4.體內：吸入給藥相比靜脈注射能使sEV 在肺中更高富集并更有效地在肺巨噬細胞中誘導 CAR 表達（流式與組織免疫熒光證明）。吸入CARmRNA@aCD206 sEVs能顯著抑制肺轉移瘤負荷（生物發光、肉眼/HE切片），延長動物生存，并產生長期免疫記憶，同時肝臟富集問題明顯緩解。



討論
通過將CAR mRNA 遞送到腫瘤組織內的巨噬細胞，可在不進行復雜體外細胞制造的情況下產生功能性CAR-M，從而優化生物分布、增強局部抗腫瘤免疫，并減少系統性副作用。
該技術在肺轉移模型上效果顯著，并顯示可誘導長期免疫記憶以預防復發。作者認為該sEV 平臺具有推廣到其他靶抗原和組織的潛力，但要注意提升 mRNA 載入效率、特異性靶向以及臨床轉化中的劑量和安全性評估。







論文中用到的NEST產品


細胞小室


使用到的NEST產品：細胞小室

1.T 細胞增殖實驗
研究人員把CFSE 標記的 T 細胞放在 Transwell 上室，把巨噬細胞（BMDM/CAR-M）放在下室，檢測是否能通過分泌因子促進 T 細胞增殖。結果顯示：CAR-M 顯著增強了 T 細胞的增殖能力。
2.樹突狀細胞成熟實驗
將未成熟DC放在上室，巨噬細胞放在下室，共培養后檢測 DC 的成熟標志物。結果顯示：CAR-M 能有效促進 DC 成熟，增強免疫激活作用。


經過與B16-MSLN 細胞共孵育預處理后的 M2 型 BMDM，在 Transwell 實驗中對 T 細胞增殖的影響


G 經過與 B16-MSLN 細胞共孵育預處理后的 M2 型 BMDM，在 Transwell 實驗中對樹突狀細胞（DC）成熟（CD11c?CD80?CD86?）的影響





NEST細胞小室的優勢

   

細胞小室在細胞實驗中很常用，如：共培養實驗、趨化實驗、細胞遷移實驗、細胞侵襲以及藥物轉運。其中，通透性支持物可以有效改善極性細胞的培養，因為這些支持物允許細胞從其基底面和頂面分泌和吸收分子，從而以更為自然的方式進行代謝，最大程度地模擬體內環境以培養某些特殊的細胞系。


?創新的邊緣設計：操作簡單便捷，減少細胞損傷，保證實驗重復性和準確性
?PC（聚碳酸酯）膜：機械強度高，化學穩定性好，能承受多種實驗條件，確保實驗結果準確可靠，不易撕破或卷曲，且取出小室時操作方便
?PET（聚酯）膜：具有良好的化學穩定性，兼容多種溶劑環境
?兼容性好：與大部分細胞固定、染色溶劑兼容，便于后續顯微觀察和長期保存
?低吸附特性：PC膜低吸附率，減少小分子蛋白和化合物的損失，確保實驗數據真實可靠
?孔徑規格豐富：提供0.4μm至8μm的全規格孔徑，提供6孔、12孔、24孔等多種規格配套多孔板，滿足不同規模的實驗需求

細胞小室訂購指南